北京百奥思科生物医学技术有限公司
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干货分享 | 活性氧ROS的流式检测
人阅读 发布时间:2024-02-29 16:21
对于刺激时间较短(通常为2小时以内)的细胞,先装载探针,后用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞。对于细胞刺激时间较长(通常为6小时以上)的细胞,先用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞,后装载探针。
原位装载探针:本方法仅适用于贴壁培养细胞。按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA,使终浓度为10微摩尔/升。去除细胞培养液,加入适当体积稀释好的DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜,通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA不少于1毫升。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次,以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。
收集细胞后装载探针:按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA,使终浓度为10微摩尔/升。细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中,细胞浓度为一百万至二千万/毫升,37℃细胞培养箱内孵育20分钟。每隔3-5分钟颠倒混匀一下,使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次,以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。直接用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞,或把细胞等分成若干份后刺激细胞。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。
说明:仅在阳性对照孔中加入Rosup作为阳性对照,其余孔不必加入Rosup。
检测对于原位装载探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察,或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。对于收集细胞后装载探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测,用激光共聚焦显微镜直接观察也可以。
参数设置使用488nm激发波长,525nm发射波长,实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似,可以用FITC的参数设置检测DCF。 04、流式方法检测需客户提供的资料 1.实验细胞2.刺激药物 实验流程细胞培养——加药刺激——细胞标记——流式上机检测——结果分析 结果1.流式原始数据2.数据分析结果3.实验报告,包括仪器,试剂及实验步骤