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microRNA表达抑制研究
人阅读 发布时间：2020-06-08 09:53
基因功能研究中使用了过表达方法，就需要辅以基因表达抑制的策略，从而使基因功能得以确认。microRNA的功能缺失性（loss-of-function）研究方法与常规基因研究有很多相似之处，但基于microRNA自身的特点，如分子量小、特殊的加工成熟机制及作用机制等，使得一些抑制表达的技术不同于常规的研究方法。
一、基因水平抑制microRNA衰达
基因敲除小鼠广泛用于基因功能的研究，已有多种相似的技术用于microRNA调控研究。例如，条件性敲除microRNA加工因子Dicerl，可得到所有成熟microRNA的缺失体；microRNA基因敲除小鼠用于功能研究；microRNA与其作用靶基因作用位点的突变等。Dicerl突变或敲除所得的模式动物小鼠，其表型的变化可以阐释microRNA在许多发育过程中所发挥的重要作用，如Dicer l缺失的小鼠胚胎在发育7.5天便停止，并且伴随Oct4等干细胞标志基因的低表达。可见microRNA在维持干细胞早期发育过程中可能发挥了极为重要的作用。条件性Dicer失活可以表明microRNA在细胞凋亡、肢体形成等过程中是不可或缺的，microRNA在生命体活动中发挥重要功能。
microRNA经常存在于功能高度相关的家族内甚至序列可以完全相同，这使得通过表达抑制来研究某个microRNA的功能变得尤其困难，如Let-7家族、miR-17 -92 cluster均有多个成员，改变其中单个microRNA会影响到相关microRNA的功能，这更增加了研究难度。研究蛋白质编码基因内含子区域microRNA也会存在相同的问题。microRNA作用位点突变用于功能研究仅限于靶基因明确受某microRNA调控的情况，因而也不适用于靶基因尚不十分明确的microRNA功能研究。基于此局限性，目前多选用修饰后的反义核酸分子沉默特异microRNA，以便进行单个microRNA功能研究。
二、反义核酸分子抑制microRNA表达
采用非基因方式沉默microRNA用于其功能研究的方法，主要是利用反义核酸分子与靶microRNA互补结合，达到抑制microRNA表达水平的目的。此类修饰物包括2’-0甲基修饰物、LNA修饰物、anti-microRNA抑制剂等。2’-0甲基修饰物是一种用于microRNA体外功能研究的不可逆化学修饰物，若要用于体内研究则需另外的修饰。胆固醇共轭连接单链寡核昔酸（antagomirs）便是在2’-0甲基修饰基础上，采用共价结合胆固醇以达到稳定寡核昔酸的目的，可有效地在体内发挥抑制功能。miR-122在肝脏内特异表达，经尾静脉注射小鼠antagomirs-122，可明显降低其表达水平，而且该方法可以抑制广泛表达的microRNA，如miR-16等。Antagomirs有剤量依赖性，加入后24小时发挥作用，可持续至少3周。因此，antagomirs用于可获得microRNA长期有效抑制的结果，并且不会影响同一基因簇内其他microRNAs。需要注意的是，Antagomirs在脑组织中没有抑制作用，可能是由于antagomirs不能有效通过血脑屏障，同时在妊娠雌鼠中注射不会影响到胎鼠也提示antagomirs可能也被血-胎盘屏障所阻隔，因此，要将antagomirs用于神经系统或胚胎发育研究，可以采用直接给药的方式。
LNA用于microRNA原位杂交，有很多优势，这些优势同样适用于修饰互补核酸分子，以用于抑制microRNA表达水平。LNA是一种双环结构的RNA类似物，其核糖磷酸骨架上的吠喃环通过一个N型糖昔键（2’-O，4’-C糖昔键）被锁定。在寡核昔酸探针中引入一个LNA分子，在与相应的DNA杂交，解链温度会提高1-8℃，而在与RNA杂交时解链温度会提高2-10℃。LNA修饰后的寡核昔酸探针与互补的RNA结合后具有很好的双链稳定性，LNA的原位杂交信号主要来源于成熟microRNA分子，而非其前体，这些都使得LNA修饰后的寡核昔酸可有效抑制其目的microRNA，同时还可増加发光物修饰，荧光显微镜下便可一目了然的观察其转染效率。
三、microRNA inhibitor与microRNA antagomir的区别
microRNA inhibitor是化学修饰的专门针对细胞中特异靶microRNA的抑制剂，通过特异地靶向抑制某个microRNA分子，可以削弱内源microRNA的基因沉默效应，提高蛋白表达量，进行功能缺失性研究，可以用来筛选microRNA靶位点，筛选调控某一基因表达的microRNA，筛选影响细胞发育过程的microRNA等。microRNA antagomir是经过特殊化学修饰的microRNA拮抗剂，通过与体内（在动物实验中可用全身或局部注射、吸入、喂药等方法进行给药）的成熟microRNA强竞争性结合，阻止microRNA与其靶基因microRNA的互补配对，抑制microRNA发挥作用，具有更高的稳定性和抑制效果。
一、基因水平抑制microRNA衰达
基因敲除小鼠广泛用于基因功能的研究，已有多种相似的技术用于microRNA调控研究。例如，条件性敲除microRNA加工因子Dicerl，可得到所有成熟microRNA的缺失体；microRNA基因敲除小鼠用于功能研究；microRNA与其作用靶基因作用位点的突变等。Dicerl突变或敲除所得的模式动物小鼠，其表型的变化可以阐释microRNA在许多发育过程中所发挥的重要作用，如Dicer l缺失的小鼠胚胎在发育7.5天便停止，并且伴随Oct4等干细胞标志基因的低表达。可见microRNA在维持干细胞早期发育过程中可能发挥了极为重要的作用。条件性Dicer失活可以表明microRNA在细胞凋亡、肢体形成等过程中是不可或缺的，microRNA在生命体活动中发挥重要功能。
microRNA经常存在于功能高度相关的家族内甚至序列可以完全相同，这使得通过表达抑制来研究某个microRNA的功能变得尤其困难，如Let-7家族、miR-17 -92 cluster均有多个成员，改变其中单个microRNA会影响到相关microRNA的功能，这更增加了研究难度。研究蛋白质编码基因内含子区域microRNA也会存在相同的问题。microRNA作用位点突变用于功能研究仅限于靶基因明确受某microRNA调控的情况，因而也不适用于靶基因尚不十分明确的microRNA功能研究。基于此局限性，目前多选用修饰后的反义核酸分子沉默特异microRNA，以便进行单个microRNA功能研究。
二、反义核酸分子抑制microRNA表达
采用非基因方式沉默microRNA用于其功能研究的方法，主要是利用反义核酸分子与靶microRNA互补结合，达到抑制microRNA表达水平的目的。此类修饰物包括2’-0甲基修饰物、LNA修饰物、anti-microRNA抑制剂等。2’-0甲基修饰物是一种用于microRNA体外功能研究的不可逆化学修饰物，若要用于体内研究则需另外的修饰。胆固醇共轭连接单链寡核昔酸（antagomirs）便是在2’-0甲基修饰基础上，采用共价结合胆固醇以达到稳定寡核昔酸的目的，可有效地在体内发挥抑制功能。miR-122在肝脏内特异表达，经尾静脉注射小鼠antagomirs-122，可明显降低其表达水平，而且该方法可以抑制广泛表达的microRNA，如miR-16等。Antagomirs有剤量依赖性，加入后24小时发挥作用，可持续至少3周。因此，antagomirs用于可获得microRNA长期有效抑制的结果，并且不会影响同一基因簇内其他microRNAs。需要注意的是，Antagomirs在脑组织中没有抑制作用，可能是由于antagomirs不能有效通过血脑屏障，同时在妊娠雌鼠中注射不会影响到胎鼠也提示antagomirs可能也被血-胎盘屏障所阻隔，因此，要将antagomirs用于神经系统或胚胎发育研究，可以采用直接给药的方式。
LNA用于microRNA原位杂交，有很多优势，这些优势同样适用于修饰互补核酸分子，以用于抑制microRNA表达水平。LNA是一种双环结构的RNA类似物，其核糖磷酸骨架上的吠喃环通过一个N型糖昔键（2’-O，4’-C糖昔键）被锁定。在寡核昔酸探针中引入一个LNA分子，在与相应的DNA杂交，解链温度会提高1-8℃，而在与RNA杂交时解链温度会提高2-10℃。LNA修饰后的寡核昔酸探针与互补的RNA结合后具有很好的双链稳定性，LNA的原位杂交信号主要来源于成熟microRNA分子，而非其前体，这些都使得LNA修饰后的寡核昔酸可有效抑制其目的microRNA，同时还可増加发光物修饰，荧光显微镜下便可一目了然的观察其转染效率。
三、microRNA inhibitor与microRNA antagomir的区别
microRNA inhibitor是化学修饰的专门针对细胞中特异靶microRNA的抑制剂，通过特异地靶向抑制某个microRNA分子，可以削弱内源microRNA的基因沉默效应，提高蛋白表达量，进行功能缺失性研究，可以用来筛选microRNA靶位点，筛选调控某一基因表达的microRNA，筛选影响细胞发育过程的microRNA等。microRNA antagomir是经过特殊化学修饰的microRNA拮抗剂，通过与体内（在动物实验中可用全身或局部注射、吸入、喂药等方法进行给药）的成熟microRNA强竞争性结合，阻止microRNA与其靶基因microRNA的互补配对，抑制microRNA发挥作用，具有更高的稳定性和抑制效果。
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