Y2H、Co-IP和GST-Pull Down，PPI中应该如何选择？

蛋白相互作用在信号通路研究中较为常见，经典的方法有：CO-IP、GST-pull down、酵母双杂交系统。

 

相较于酵母双杂交、pull down等方法，CO-IP之所以能成为蛋白互作的经典方法，它捕获的蛋白互作发生在所研究的特定组织细胞内，保存了互作蛋白及复合体的“内源”状态。

三者之间有哪些区别？在实验过程中，研究者应该选择哪种方法？

 

了解Co-IP之前，先来了解IP。

免疫沉淀

免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）是一种利用抗体特异性结合抗原的特性来分离和富集特定蛋白质或蛋白质复合物的技术。

其原理基于抗原与抗体之间的高度特异性相互作用。

首先，将含有目标抗原的样本（如细胞裂解液或组织匀浆）与针对目标抗原的特异性抗体混合，抗体与目标抗原结合形成抗原-抗体复合物。

接着，加入能与抗体结合的介质，如Protein A，它们可以特异性地结合抗体的Fc段，使抗原-抗体复合物附着在介质上。

随后，通过离心等方法将附着有抗原-抗体复合物的介质沉淀下来，从而将目标抗原从样本中分离出来。

经过多次洗涤步骤去除非特异性结合的杂质后，再通过加热或加入变性剂等方式使抗原-抗体复合物解离，释放出目标抗原X。

最后，可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE）、免疫印迹（Western blotting）等方法对目标抗原进行进一步的分析和鉴定。

 

总结下，IP就是检测单个蛋白的状态。

 

酵母双杂交系统（Y2H）

酵母双杂交系统是一种用于研究蛋白质相互作用的经典遗传学方法，其原理基于真核生物转录因子的结构特性。许多真核生物转录因子由两个可分离的结构域组成，即 DNA 结合结构域（DNA - binding domain，BD）和转录激活结构域（Activation domain，AD）。这两个结构域虽然在空间上是分开的，但只有当它们在空间上相互靠近并协同作用时，才能激活下游报告基因的转录。

 

在酵母双杂交系统中，将待研究的两种蛋白质分别与BD和AD进行融合表达，形成“诱饵”蛋白（与BD融合）和“猎物”蛋白（与AD融合）。当这两种蛋白质之间存在相互作用时，BD 和AD会被拉近，从而形成一个有功能的转录因子，激活报告基因（如LacZ、HIS3等）的表达。

 

通过检测报告基因的表达产物，就可以判断“诱饵”蛋白和“猎物”蛋白之间是否存在相互作用。通常在现实情况中，与蛋白X存在潜在互作可能的候选蛋白会有好几种（Y，Z，A，B等），这时我们就可以通过酵母双杂交在体内筛选与X有相互作用的蛋白Y。

竟然我们在体内验证过，那么蛋白X和蛋白Y在体外是否也存在相互作用了？这个时候我们可以用到Co-IP了~

 

免疫共沉淀（Co-IP）

Co-IP的原理和IP是一样的。首先利用针对目标蛋白X的特异性抗体与细胞裂解液中的目标蛋白X结合，形成抗原-抗体复合物；接着通过Protein A介质捕获抗体的Fc段，将目标蛋白X及其相互作用蛋白Y共同沉淀下来；经过洗涤去除非特异性结合的杂质后，通过变性处理使复合物解离，释放出与目标蛋白X结合的其他蛋白质；最后通过质谱分析、Western blot等方法鉴定这些互作蛋白，从而揭示蛋白质之间的相互作用。

 

总结下，在体外验证X和Y之间有联系。但是，X和Y是直接作用，还是间接作用，无法从Co-IP获得验证，需要协助GST-Pull Down。

GST-Pull Down

将靶蛋白和GST组成的融合蛋白固定在谷胱甘肽（GSH）亲和树脂上，作为与目的蛋白亲和支撑物,充当一种“诱饵蛋白”，目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白)，洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析，从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白，“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得，此方法用于体外直接的相互作用检测。

 

那作为研究者，如何选择这三种技术？

A:

在PPI的研究中，通常采用Y2H进行初步筛选，Co-IP和GST Pull Down技术用于后续验证。

其中，GST Pull Down技术能够有效验证蛋白X与蛋白Y是否直接结合。

与之不同的是，Y2H和Co-IP的结果可能包含间接作用以及非特异性作用，因此在验证蛋白直接相互作用时，GST Pull Down技术更具针对性和准确性。