线粒体，糖酵解，T细胞很多年来一直是研究热点，那么究竟是什么让这篇斩获16.6呢？就跟小助手来一起学习一下思路吧！

1.细胞代谢与T细胞耗竭关系：文章通过分析疲惫T细胞亚群，揭示了其在转录、表观遗传、代谢等方面存在明显的差异，特别是与线粒体基因表达和代谢重编程之间的关系。

2.线粒体缺陷导致T细胞耗竭：通过使用线粒体不足的T细胞的基因小鼠模型，文章阐明了代谢转变足以诱导Tpex细胞中与疲劳相关的基因表达程序。

3.氧化还原平衡和ROS的作用：文章指出，线粒体下降导致葡萄糖转向有氧糖酵解，减少了NADPH的生成，引起氧化还原应激和ROS的积累。研究发现HIF-1α是一个重要的转录调控因子，促进糖酵解重编程和终末T细胞疲劳。

4.线粒体磷酸携带体（mPiC）的作用：通过对mPiC基因的消融，文章提供了遗传证据，表明线粒体呼吸受损不仅是T细胞功能障碍的结果，而且是其促使疲劳相关基因表达程序的原因。

5.HIF-1α在T细胞耗竭中的作用：文章强调了HIF-1α的作用，它被发现是促使终末T细胞疲劳的一个调节因子。这与之前的研究相符，表明HIF-1α的活性既支持T细胞的炎性功能，又加速其衰竭。

6.代谢干预策略：最后，文章提到通过调控线粒体健康和/或限制糖酵解代谢的药理和基因策略，有望为维持（或恢复）在癌症免疫疗法中的T细胞功能提供理论基础。

题目：线粒体功能障碍通过HIF-1α介导的糖酵解重编程促使前体T细胞向终末耗竭状态过渡

杂志：nature communications

影响因子：IF=16.6

发表时间：2023年10月

研究背景

T细胞耗竭是癌症和持续感染的特征，表现为抑制性受体上调、细胞因子分泌减少和细胞溶解活性受损。终末耗竭T细胞不断由前体群体（Tpex）补充，但Tpex维持和调控其耗竭的代谢原则尚不完全清楚。该研究揭示了Tpex细胞的干性维持和功能性耗竭的分子机制，发现线粒体不足是导致T细胞功能耗竭的细胞内触发因素。

数据来源

研究思路

分析疲惫T细胞亚群找出差异，对差异涉及的代谢途径进行分析，构建代谢途径涉及到的单一细胞器缺陷小鼠模型，分析T细胞是否受到了影响。和野生型细胞做代谢差异性分析，找出具体代谢物。制备该代谢物表达缺失的KO细胞系，与野生型对照组DEG分析，最后在in vitro实验中验证。

主要结果

1. 富集分析和有氧呼吸相关代谢的测定

通过对慢性感染野生型（WT）小鼠进行了单细胞（sc）RNA测序确定了六个主要的疲劳T细胞亚群，计算代谢途径的基因富集分数揭示了在Tpex到最终分化T细胞之间线粒体和呼吸链基因表达的急剧下降。通过FACS分选分离了Ly108+ Tpex和Tim-3+ Tex细胞后，计算糖酵解和线粒体代谢对ATP产生的贡献时，发现Tpex细胞主要依赖于线粒体氧化磷酸化OXPHOS，而Tex细胞对有氧糖酵解的依赖性大约是其对OXPHOS的2.5倍。通过利用mito-Dendra2的绿色荧光（该蛋白的绿色荧光与线粒体的质量/体积相关），可以轻松检测到Tpex细胞的线粒体含量明显高于Tex细胞。    

图1 T细胞疲劳表现为代谢重编程

2. 生成与验证小鼠模型

为了直接探讨线粒体生物能学的作用，生成了T细胞特异性缺失编码线粒体磷酸载体（mPiC）的Slc25a3基因的小鼠。Seahorse细胞外流分析显示抗CD3/CD28激活的mPiC缺陷T细胞的基础和最大耗氧量显著降低，与较高的糖酵解活性相一致。对WT和mPiC缺陷T细胞抗原刺激后TNFα、IFNγ和IL-2的多功能表达分析。用流式细胞术分析在静息和抗CD3/CD28刺激T细胞中的凋亡情况。这些数据表明mPiC缺陷导致T细胞的表型和功能的枯竭。    

图2 遗传抑制线粒体ATP产生促使T细胞进行糖酵母-转录重编程    

 

3. 代谢差异性分析以及确定信号通路和转录调节因子

使用液相色谱和质谱（LC/MS）对它们的代谢组进行了分析，在mPiC缺陷的T细胞中，最下调的代谢物之一是几种糖酵解中间产物以及NADPH。GSEA分析显示mPiC缺陷与ROS通路基因表达特征（M5938）之间存在强烈的相关性，并且ROS解毒相关基因表达上调。给WT和mPiC缺陷的T细胞补充了N-乙酰半胱氨酸（NAC）可以使mPiC缺陷的T细胞中的细胞ROS水平正常化，防止了耗竭标志的表达，并恢复了它们的细胞因子产生。对WT和mPiC缺陷的T细胞基因上游的转录因子进行了KEGG通路富集分析和DEGs预测分析发现HIF-1α作为潜在调节因子，通过RNA测序分析发现HIF-1α基因的表达在WT和mPiC缺陷的T细胞中是相似的，然而通过流式细胞术分析发现HIF-1α蛋白水平在mPiC缺陷的T细胞中显著增加。以上说明了氧化应激稳定了Tpex细胞中HIF-1α蛋白水平。    

图4 线粒体不足导致ROS介导的HIF-1α蛋白稳定化

4. HIF-1α的功能分析及在肿瘤环境下的小鼠实验

将Hif1afl/flCd4Cre小鼠与P14动物交叉，并将相等数量的WT（GFP+）和HIF-1α缺失的T细胞（tdTomato+）共同转移至慢性感染的WT宿主小鼠培养后分离供体P14 WT和HIF-1α缺失T细胞，进行FACS分选。单细胞RNA测序后通过UMAP可视化及DEG分析找出HIF-1α缺失如何影响慢性病毒感染期间终末T细胞耗竭。使用WT和HIF-1α缺失T细胞的单细胞RNA测序进行KEGG通路富集分析发现糖酵解酶的表达在HIF-1α缺失的Tpex和Tex细胞中显著下调。将1×106经过或未经过2-DG处理的抗hCD19 CAR T细胞在MC38肿瘤接种后的7天共同转移至Rag1–/–小鼠，所有这些发现表明，线粒体不足和HIF-1α介导的糖酵解代谢共同促成T细胞耗竭，而药物抑制糖酵解代谢是一种可行的代谢干预策略，可在慢性病毒感染和癌症免疫治疗期间维持T细胞的干性、长寿和功能。    

图5 HIF-1α控制病毒特异性T细胞的终末分化    

图6 HIF-1α介导的糖酵解代谢促进T细胞耗竭

文章小结

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