北京百奥思科生物医学技术有限公司
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实验干货丨微生物学检测——菌落总数
人阅读 发布时间：2023-07-18 08:56
常见操作方法
菌落计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（Most-Probable-Number Method，简称MPN法），其中平皿法可分为倾注平皿法和涂布平皿法，常见的菌落总数操作方法见表1。
| 测试标准 |
适用范围 |
操作方法 |
| GB4789.2-2022 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》 |
食品 |
倾注平皿法/菌落总数测试片 |
| FDA- Bacteriological Analytical Manual Chapter 3：2001《Aerobic Plate Count》 |
食品 |
倾注平皿法/螺旋板法 |
| GB/T13093-2006 《饲料中细菌总数的测定》 |
饲料 |
倾注平皿法 |
| GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物检验方法 细菌总数测定》 |
游泳池水 |
倾注平皿法 |
| GB/T5750.12—2023《生化饮用水标准检验方法 微生物指标》 |
饮用水/水源水 |
倾注平皿法/酶底物法 |
| WS 394-2012 《公共场所集中空调通风系统卫生规范 附录D 集中空调送风中细菌总数检验方法》 |
环境 |
六级筛孔撞击式微生物采样器 |
| GB15979-2002 《一次性使用卫生用品卫生标准 附录B2》 |
一次性卫生用品 |
倾注平皿法 |
| 《化妆品安全技术规范》2015版 |
化妆品 |
倾注平皿法 |
| BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》 |
化妆品 |
平皿法/膜过滤法 |
| USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS: MICROBIAL ENUMERATION TESTS》 |
药品 |
平皿法/薄膜过滤法/MPN法 |
| BP Appendix XVI B 《Microbiological Examination of Non-sterile Products》 |
||
| EP 9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》 |
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| ChP1105 2020版《非无菌产品微生物限度检查：微生物限度计数》 |
表1 常见菌落总数的操作方法汇总
根据上表的适用范围和操作方法可得出，平皿法是使用范围最广。
根据测试标准适用范围和样品特性：
A.平皿法因可操作性性强，会更多用于污染度高的被检样品；
B.薄膜过滤法适用于测试量需求大且污染度一般的液体样品；
C.MPN法可用于微生物计数时精确度较差时，包括对于某些微生物污染度很小的样品。
故在日常测试中，可根据样品的污染度情况去选择更合适的菌落总数测试操作方法。
样品的取样量与稀释液选择
样品的取样量与其质量标准或测试方法去选择，对于官方标准未明确取样量的，亦可根据结果的代表性加大取样量。稀释缓冲液的选择则是要求样品在稀释缓冲液中能够充分混合，从而保证样品的均一性，故不同样品，会有不同的稀释液需求。日常工作中，常见的稀释缓冲液与要求见表2。
| 测试标准 |
样品量 |
稀释液 |
备注 |
| GB4789.2-2022 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》 |
25g/mL |
无菌生理盐水/磷酸盐缓冲液 |
|
| FDA- Bacteriological Analytical Manual Chapter 3：2001《Aerobic Plate Count》 |
50g/mL |
磷酸盐缓冲液/无菌水 |
|
| GB/T13093-2006 《饲料中细菌总数的测定》 |
25g/10g |
0.85%生理盐水/磷酸盐缓冲液 |
|
| GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物检验方法 细菌总数测定》 |
原液 |
无菌生理盐水 |
|
| GB/T5750.12—2023《生化饮用水标准检验方法 微生物指标》 |
原液 |
无菌生理盐水 |
|
| WS 394-2012 《公共场所集中空调通风系统卫生规范 附录D 集中空调送风中细菌总数检验方法》 |
28.3L/min，（5-15）min |
不适用 |
|
| GB15979-2002 《一次性使用卫生用品卫生标准 附录B2》 |
10±1g |
无菌生理盐水（200mL） |
不进行梯度稀释，做5平行 |
| 《化妆品安全技术规范》2015版 |
10g/mL |
无菌生理盐水 |
无法充分溶解稀释液中的样品可加吐温80和/或石蜡 |
| BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》 |
1:10（样品：加稀释液后） |
无菌生理盐水、磷酸盐缓冲液、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液等
|
最终的取样量与稀释液，需通过样品方法学适用性验证方能使用。 |
| USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS:MICROBIAL ENUMERATION TESTS》 |
|||
| BP Appendix XVI B 《Microbiological Examination of Non-sterile Products》 |
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| EP 9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》 |
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| ChP1105 2020版《非无菌产品微生物限度检查：微生物限度计数》 |
表2 常见的稀释缓冲液信息汇总
常见培养条件
菌落总数的培养条件会因不同的样品类型或制定机构而有所差异，其差异包括培养基、培养温度和培养时间的选择。菌落总数常见的培养条件见表3。
| 测试标准 |
培养基 |
培养温度 |
培养时间 |
| GB4789.2-2022 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》 |
平板计数琼脂（PCA） |
36±1℃（水产品30±1℃） |
48±2h（水产品72±3h） |
| FDA-Bacteriological Analytical Manual Chapter 3：2001《Aerobic Plate Count》 |
35±1℃（牛奶32±1℃） |
48±2h |
|
| GB/T13093-2006 《饲料中细菌总数的测定》 |
营养琼脂（NA） |
30±1℃ |
72±3h |
| GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物检验方法 细菌总数测定》 |
36±1℃ |
48h |
|
| GB/T5750.12—2023《生化饮用水标准检验方法 微生物指标》 |
36±1℃ |
48±2h |
|
| WS 394-2012 《公共场所集中空调通风系统卫生规范 附录D 集中空调送风中细菌总数检验方法》 |
35~37℃ |
48h |
|
| GB15979-2002 《一次性使用卫生用品卫生标准 附录B2》 |
35±2℃ |
48h后 |
|
| 《化妆品安全技术规范》2015版 |
卵磷脂、吐温80-营养琼脂 （LTNA） |
36±1℃ |
48±2h |
| BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》 |
胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA） |
32.5±2.5oC
|
72±6h |
| USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS: MICROBIAL ENUMERATION TESTS》 |
3~5天 |
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| BP Appendix XVI B 《Microbiological Examination of Non-sterile Products》 |
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| EP 9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》 |
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| ChP1105 2020版《非无菌产品微生物限度检查：微生物限度计数》 |
菌落总数的测定，不同样品有不同的特性，故在进行此方面卫生学测试时，结合行业需求，以及样品的生产工艺、消费对象、使用方式等需求，选择合适的测试操作流程，同时保证在报告结果时，亦需根据市场所选用的方法进行报告结果。
综合以上，卫生学的菌落测试在实验操作中虽然有差异，但总体的差异性不大，比如培养基都是非选择性生长培养基，培养温度基本在35℃左右，培养时间则温度越高，时间则可减少。故保证菌落总数测试结果的准确性与可靠性时，根据实际需求，通过调节测试方法的取样、稀释液、培养条件等来建立更符合本实验室的菌落总数测试方法。
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