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原核蛋白表达的整体实验流程和具体实验结果

人阅读 发布时间:2023-06-06 08:57

一、假设目标蛋白的信息

名称:  XXX蛋白       

大小:  30 kDa       

缓冲液:PBS           

浓度:  0.6mg/mL   

体积:  6mL (3管分装)

标签:   仅6Xhis       

纯度:  90%以上
 

二、实验过程 

1蛋白表达载体的构建

1.1 序列二基因序列密码子优化后合成及构建

Optimized for your reference:

CATATGxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxCTCGAG

合成时候带上上下游酶切位点分别是Nde I,Xho I(黄色阴影),并克隆到原核表达载体Pet24a载体。

1.2 DNA测序

将经菌落PCR鉴定为阳性克隆测序,测序工作由华大基因完成(见附件)。
 

2 构建正确的Pet24a-序列二表达载体在大肠杆菌中的表达

2.1 转化至大肠杆菌BL21(DE3)

常规CaCl2法。

2.2 IPTG诱导融合蛋白的表达

2.2.1 挑取转化平板上的单克隆接种于含50 μg/ml Kan的3 ml LB培养液的试管中,37℃ 220 rpm振摇过夜;      

2.2.2 次日按1:100接种于50 μg/ml Kan的30 ml LB培养液中,37℃ 220 rpm振摇至菌体OD600为0.4 (约2h);

2.2.3 取出1 ml培养物,12000g室温离心2 min,弃上清,用100 μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀;

2.2.4 向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/l,37℃ 220 rpm振摇4 h,诱导序列二蛋白表达;

2.2.5取出1 ml培养物,12000g室温离心2 min,弃上清,用100 μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀,剩余培养物4℃ 4000g离心12 min,弃上清,沉淀置-20℃冻存。

2.3 表达产物分布的确定

2.3.1 将表达菌体重悬于400 μl Ni-IDA Binding-Buffer(20 mM Tris-HCl,5 mM咪唑,0.5 M NaCl,pH8.0);

2.3.2  重悬液进行超声波破碎(冰浴中进行):功率100 W,工作4 sec,间歇8 sec,共10 min;

2.3.3 超声破碎液4℃ 12000g离心20 min,取10 μl上清液加入等量的2×上样缓冲液,沉淀用400 μl 1×上样缓冲液重悬后取5 μl,恒压150 V进行12% SDS-PAGE,考马斯亮蓝R250染色显带。
 

3融合蛋白的纯化

3.1 将1 L诱导表达的培养菌体沉淀用20 ml Ni-IDA Binding-Buffer重悬后,超声破碎(功率200 W,工作4 sec,间歇8 sec,共20 min),4℃ 12000g离心20 min,取上清;

3.2 利用Biologic LP层析系统,上清液以0.5 ml/min流速上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA -Sepharose CL-6B亲和层析柱;

3.3 用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5 ml/min流速冲洗,至流出液OD280值到达基线; 

3.4 用Ni-IDA Washing-Buffer(20 mM Tris-HCl,30 mM咪唑,0.5 M NaCl,pH8.0)以1 ml/min流速冲洗,至流出液OD280值到达基线;

3.5 用Ni-IDA Elution-Buffer(20 mM Tris-HCl,250 mM咪唑,0.5 M NaCl,pH8.0)以1 ml/min流速洗脱目的蛋白,收集流出液;

3.6 进行12% SDS-PAGE分析。


三、实验结果
图片2.png

SDS-PAGE结合考染鉴定纯化的XXX蛋白

1-4泳道分别指XXX蛋白放大表达后的全菌、破碎上清、纯化时20mM咪唑洗脱液以及250mM咪唑洗脱液。

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