书本不会教的：环状 RNA（circRNA） 序列查询及引物设计

环状 RNA(circRNA) 是一类特殊的非编码 RNA 分子,也是 RNA 领域的研究热点。circRNA 分子呈封闭环状结构,不受 RNA 外切酶影响,表达更稳定,不易降解。circRNA 分子富含 microRNA(miRNA) 结合位点,在细胞中充当 miRNA 分子海绵 (miRNA sponge)，可以解除 miRNA 对其靶基因的抑制作用。

在 circRNA 的研究中，设计出特异的 circRNA 引物极为关键。以下简介在 circRNA 的研究中,如何准确快速获得感兴趣 circRNA 序列并设计对应的环状 RNA 引物。

一、序列查询

如果已经知道 circRNA 的数据库 ID,可以在 circRNA 数据库如：circBase 中进行查找：

1.首先，进入 circBase 主页，http://circbase.org/，输入 circRNA 的 ID。

2.点击 Search，进入搜索结果，在结果界面中提供了 circRNA 的种属、染色体位置、ID、基因组中序列长度、剪接后 RNA 长度、文献等相关信息，点击 FASTA

3.进入如下界面，选择 spliced 后点击最下方的 search 键。

4.即可下载 FASTA 格式的 circRNA 序列，下载的文件可以用记事本打开。

二、circRNA 的引物设计

1.获得 circRNA 序列后。将3端的序列移置序列 5 端，进行序列转换。

转换前序列:

ATTTCAACACTACACTTGCACAATGTCTTTGAAACCAAGAGTAGTAGATTTTGATGAAACATGGAACAAACTTTTGACGACAATAAAAGCCGTGGTCATGTTGGAATACGTCGAAAGAGCAACATGGAATGACCGTTTCTCAGATATCTATGCTTTATGTGTGGCCTATCCTGAACCCCTTGGAGAAAGACTTTATACAGAAACTAAGATTTTTTTGGAAAATCATGTTCGGCATTTGCATAAGAGAGTTTTGGAGTCAGAAGAACAAGTACTTGTTATGTATCATAGGTACTGGGAAGAATACAGCAAGGGTGCAGACTATATGGACTGCTTATATAG

转换后序列:

AGATATCTATGCTTTATGTGTGGCCTATCCTGAACCCCTTGGAGAAAGACTTTATACAGAAACTAAGATTTTTTTGGAAAATCATGTTCGGCATTTGCATAAGAGAGTTTTGGAGTCAGAAGAACAAGTACTTGTTATGTATCATAGGTACTGGGAAGAATACAGCAAGGGTGCAGACTATATGGACTGCTTATATAGATTTCAACACTACACTTGCACAATGTCTTTGAAACCAAGAGTAGTAGATTTTGATGAAACATGGAACAAACTTTTGACGACAATAAAAGCCGTGGTCATGTTGGAATACGTCGAAAGAGCAACATGGAATGACCGTTTCTC

2.根据转换后的序列设计引物，引物设计可以使用 Oligo、Primer 等软件。

注意

①引物在剪接点 2 端,即 PCR 产物跨越剪接点;

②产物长度在 100bp 左右。

3.利用 NCBI 的 primer blast 工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome)对设计的引物进行比对，比对结果应该显示引物无特异性扩增序列。

三、无 circRNA 编码(ID)

如果没有 circRNA 的编码(ID),也可以根据染色体位置查找 circRNA 的 DNA 序列。

1.首先进入 UCSC 或 NCBI 数据库(以 UCSC 数据库为例)，网址：http://genome.ucsc.edu/，选择对应的基因组数据库。

2.进入基因组数据库后，在搜索栏中输入染色体位置，格式为:chr(染色体号):染色体位置 1- 染色体位置 2

3.选择 View 下的 DNA 选项

4.计入如下界面,点击 get DNA:

5.即可获得 FASTA 格式的 DNA 序列

​

6.根据文献或其他证据确定 circRNA 的剪接位点,在剪接位点下游选择 150-200 碱基转置到剪接位点上游的 150-200 碱基处。再按照「二」的方法进行引物设计即可。

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