北京百奥思科生物医学技术有限公司

2 年

手机商铺

商家活跃:
产品热度:

北京百奥思科生物医学技术有限公司

入驻年限:2 年

  • 联系人:

    张经理

  • 所在地区:

    北京 海淀区

  • 业务范围:

    试剂、技术服务、论文服务、细胞库 / 细胞培养、抗体

  • 经营模式:

    科研机构

在线沟通

公司新闻/正文

流式细胞术——绝对计数

人阅读 发布时间:2020-06-03 09:16

细胞绝对计数
流式细胞术除了应用于检测标记物、细胞占比以外,还经常用于细胞绝对计数。

​接下来以CD34细胞绝对计数为例进行简要讲解。

目前根据机器的型号不同,可以有两种计数方法。常用的是用计数微球。打主意实验流程为:试管内事先已经有固定数目的计数微球和染色抗体。按要求加入固定体积的抗凝血液,裂解红细胞后上机。记录一千个微球,同时就会得到不同染色区域细胞的数量。这样就可以算出单位体积血液内CD34细胞的绝对数目了。另外一个方法是有些流式细胞仪是使用微泵加样,而不是连续吸取样本,这样样本的体积是已知的,记录一次就是所有样本的数量,可以算出细胞浓度,进而计算出细胞数目。

目前流式细胞术计数CD34+细胞因具有快速、简便、可定量等特点,已广泛应用于移植物中HSC/HPC数量的检测及确定采集时机等。流式细胞术计数CD34+细胞经历了从单参数到多参数分析、从双平台到单平台计数、从各实验室自由抗体组合到商业化试剂盒应用等一系列的演变。双平台计数法先通过流式细胞术分析得出CD34+细胞百分比,再结合血细胞计数仪计数的白细胞数得出CD34+细胞绝对数。不同实验室间的血细胞计数仪可能存在一定的系统误差,洗涤过程中易造成某些细胞成分的丢失,因此双平台CD34+细胞计数法在不同实验室间存在很大的变异性;单平台CD34+细胞计数法是在计数管中加入已知数量的荧光微球,采用流式细胞术获取CD34+细胞百分比的同时,根据获取的已知密度的荧光微球数来计算出CD34+细胞绝对数。单平台计数法裂解红细胞后不需洗涤,不需要采用血细胞计数仪计数白细胞,因此系统误差小,被认为是首推的CD34+细胞计数方法。

一、标本采集

1.患者信息及标本标识:所有检测用标本应及时贴上标签,标签上应注明患者的姓名、唯一的识别码、标本类型、标本采集的日期和时间。填写检查申请单,申请单应和标本粘贴在一起送检,申请单上应标明患者的姓名、患者唯一的识别码、年龄、性别、标本采集日期和时间、申请医师的姓名和标本类型(如:全血)、检测项目及相关的临床信息,进行双平台检测时还需提供白细胞计数和分类信息。

2.抗凝剂的选择:标本采用不同的抗凝剂抗凝时,其稳定性会不同,乙二安四乙酸钾盐(EDTA-K2/EDTA-K3)抗凝的标本,常温下可稳定保存12~24 h,超过24 h的EDTA盐抗凝标本中粒细胞可能会减少,肝素钠或枸橼酸钠(ACD)抗凝标本可稳定保存48 h。如果标本需用血细胞分析仪同时进行白细胞计数和分类,则应该选择EDTA盐作为抗凝剂。因此外周血标本通常采用EDTA盐抗凝,采集物通常采用ACD抗凝,骨髓和脐带血标本可采用EDTA盐、肝素钠或ACD抗凝。

3.标本质量:标本处理的步骤越多,细胞丢失就越多。而这种丢失在不同类型白细胞比例是不均等的。对于全血标本,溶血后不洗涤,可以使标本处理的步骤减到最少。

(1)标本目视观察:可观察到的问题常见有两种类型:一是变性或损坏的标本,需要立即弃之;二是在标本处理过程中出现错误操作,则需要进一步评估。错误操作问题需要记录下来,这对标本的处理、分析以及结果的解释都将很有帮助。

(2)溶血:严重溶血的标本应该放弃检测,所有可能破坏标本完整性的异常情况均应密切观察,并且记录下来,以利于后续的处理、分析和结果解释。

(3)凝血:即使是很小的血凝块也会引起血液中某些成分的选择性丢失或改变,凝血的标本应尽可能弃用。

(4)温度极限:如果标本是远距离运送到实验室,标本就有可能暴露在非允许储存温度的环境中,所以接到标本后应确认标本是否过热或过冷。即使其他所有的鉴定指标都正常,也应记录下来以利于后续的处理、分析和结果解释。

(5)错误标本标签:如果标本没有唯一标识或标本标签与患者信息不符(患者姓名与标识不符),应该拒收标本,并及时与相关医护人员沟通。

(6)标本保存时间及储存条件:可接受的标本最长保存时间取决于抗凝剂的种类、溶血剂、储存条件及细胞密度。实验室应根据使用的抗凝剂和溶血剂确定可接受的标本最长保存时间。实验室应选择适当的保存环境以及溶血方法,使保存标本的检测结果与新鲜标本之间没有明显差异。原则上标本采集后应该立即检测,但是实际操作中往往无法做到。不能立即检测的标本应该保存于4~8 ℃冰箱中。后续的标本处理和免疫染色应严格按照试剂说明书进行操作。

二、CD34+细胞绝对计数方法CD34+细胞绝对计数分为单平台和双平台两种方法。

单平台方法是首推方法,它减少了室间变异和多台仪器间的系统误差。

1.单平台方法:(1)白细胞密度和抗体用量:通过血细胞计数板或使用血细胞分析仪预先计数标本中的白细胞,并严格按照操作说明书调整细胞和抗体的最佳比例。白细胞过少的标本应减少单抗用量。白细胞过多的标本应使用含10 g/L白蛋白或其他蛋白的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释到适当密度。

(2)移液量:标本和荧光微球的移液量应精确,为了加入准确体积的已知密度的定量微球和标本,推荐采用反向抽吸法加样。使用包被有已知数量的荧光微球的标本处理管,只需移液1次;而直接在标本中加入已知密度的荧光微球悬液,需要移液2次。

(3)裂解红细胞:裂解红细胞的时间和方法按照所用溶血素说明书进行操作。采用含7-氨基放现菌素D (7-AAD)方案时应选择不含固定剂的溶血素,如氯化铵-Tris缓冲液。

(4)离心:为避免荧光微球的丢失,在裂解细胞后不要离心洗涤。

2.双平台方法:CD34+细胞绝对计数由流式细胞仪测得的CD34+细胞百分比和全血细胞分析仪测定的白细胞计数计算得到。白细胞密度与抗体用量同单平台方法,不需要采用已知数量的荧光微球管或加入荧光微球悬液。裂解红细胞按照所用溶血素说明书进行操作,裂解红细胞后离心洗涤2次。

 

上一篇

初学者的福音,分分钟教你阅读质粒图谱!

下一篇

脑缺血再灌注模型和全脑缺血动物模型(图文详解)

更多资讯

询价列表

暂时没有已询价产品

快捷询价 发送名片
    当你希望让更多商家联系你时,可以勾选后发送询价,平台会将你的询价消息推荐给更多商家。
    yanxuan

    丁香通研选

    yanxuan

    丁香通小程序

    询价知情同意
    您知悉并同意,丁香通平台展示产品并非为平台自身产品,您发起询价或试用申请后,平台将会把您已提供或按要求提供的相关信息同步提供至所咨询的具体产品商家,由商家为您提供具体产品的价格咨询或产品试用注意事项及相关试用产品或完成相应购买,因此您知悉并授权平台将您的信息进行同步共享。您有权拒绝,但您知悉将无法参加询价或试用活动。