单层贴壁细胞总蛋白的提取:

1.倒掉培养液,并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液(或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走)。

2.每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS(0.01M pH=7.2～7.3)。平放轻轻摇动1min洗涤细胞,然后弃去洗液。重复以上操作两次,共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。

3.按1ml裂解液加10μl PMSF(100mM),摇匀置于冰上。(PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。)

4.每瓶细胞加400μl含PMSF的裂解液,于冰上裂解30min,为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

5.裂解完后,用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧(动作要快),然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。(整个操作尽量在冰上进行。)

6.于4℃下12000 rpm离心5min。(提前开离心机预冷)

7.将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于-20℃保存。

组织中总蛋白的提取:

1.将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位,用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。

2.加400μl单去污剂裂解液裂(含PMSF)于匀浆器中,进行匀浆。然后置于冰上。

3.几分钟后再碾一会儿再置于冰上,要重复碾几次使组织尽量碾碎。

4.裂解30min后,即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中,然后在4℃下12000 rpm离心5min,取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。

加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取:

由于受药物的影响,一些细胞脱落下来,所以除按1)操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取:

1.将培养液倒至15ml离心管中,于2500 rpm离心5min。

2.弃上清,加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤,然后2500 rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。

3.用枪洗干上清后,加100μl裂解液(含PMSF)冰上裂解30min,裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。

4.将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000 rpm离心5min,取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。

 Loading Buffer煮细胞抽提总蛋白

1.细胞计数(约1×10⁶的细胞),离心收集细胞(2000rpm×5min);

2.预冷1×PBS 500ul重悬洗一次,转至500ul EP管(2000rpm×5min);

3.去上清,后甩一次,将上清去尽;

4.按每1×10⁶的细胞加50ul loading buffer 加入2×loading;

5.Vortex一下,煮10～15min一次×2～3次直至无粘丝;

6.每次煮好将其放于冰上,静置约2min,Vortex一下,再甩一下;

7.三次后用枪吸起,如没有粘丝,即可;

8.每次上样约5ul(50ug/ul蛋白)

RIPA裂解抽提总蛋白

1.细胞计数(约1×10⁷的细胞),离心收集细胞(2000rpm×5min);

2.预冷1×PBS 1ml重悬洗2次,转至1.5ml EP管(2000rpm×5min);

3.去上清,后甩一次,将上清去尽;

4.按照如下比例加入裂解试剂:

RIPA:300ul/1×10⁷细胞

PMSF:3ul(1:100)

Cocktail:0.3ul(1:1000)

5.吹打均匀,冰上放置30-40min,中间每10分钟Vortex一次;

6.4℃预冷离心:10000rpm ×10min;

7.收集上清,转移至已预冷新EP管,即为总蛋白。

核,浆蛋白抽提

一.收核-浆蛋白

收浆蛋白

1.细胞计数(约1.5×10⁷的细胞),离心收集细胞(1100rpm×5min);

2.用4℃预冷的PBS重悬,转至1.5mL的EP管中,离心(4000rpm×5min,4℃);

3.去上清,加入A Buffer  1mL/1×10⁷ cell,重悬,4℃放置10min,离心(2500rpm×3min,4℃);

4.去上清,加入A’ Buffer 250uL/1.5×10⁷ cell,重悬,4℃放置3min,离心(5000rpm×1min,4℃),吸取上清(上清是浆蛋白);

收核蛋白

5.再用A’ Buffer 500uL/1.5×107 cell,重悬,4℃放置3min,离心(5000rpm×1min,4℃),吸走上清,12000rpm×30sec,把上清完全吸干净;

6.剩余沉淀中加入B’ Buffer (或者RAPI)50uL,重悬(振荡),4℃放置40min(每隔10min振荡一次);

7.离心(12000×10min,4℃),取上清即为核蛋白,-80℃保存。

Buffer A的配制:

	终浓度	母液	配40Ml (10ml)溶液所需的量
Hepes PH 7.9	10mM	1M	400uL      (100 ul)
MgCl2	1.5mM	2M	30uL        (7.5 ul)
KCl	10mM	250mM	1.6mL      (400 ul)
DTT	0.5mM	0.1M	200uL       (50 ul)

剩余体积用ddH₂O补足至要求体积!

Buffer A’的配制:

Buffer A’(2ml) = 1960ul Buffer A + 40uL 10%NP-40 + 20uL 10mg/mLPMSF + 1uL Aprotinin

Buffer A’(1ml) =  980ul Buffer A + 20uL 10%NP-40 + 10uL 10mg/mLPMSF + 1uL Aprotinin

(Aprotinin可以用cocktail代替,而且只要核蛋白的时候可以不加)

Buffer B 的配制:

	终浓度	母液	配40mL(10ml)溶液所需的量
Hepes PH 7.9	20mM	1M	800uL    (200 uL)
甘油	25%	50%	20mL      (5 mL)
NaCl	0.42M	3M	5.6mL     ( 1.4 mL)
EDTA	0.2mM	0.5M	16uL      ( 4 uL)
DTT	0.5mM	0.1M	200uL    ( 50 uL)
NP-40	0.2%	10%	800uL   ( 200 uL)

剩余体积用ddH₂O补足至要求体积!

Buffer B’的配制:

Buffer B’ = 1mL Buffer B + 10uL 10mg/mLPMSF + 0.5uL Aprotinin(可以用cockltail代替)

核基质蛋白抽提Protocol

1、细胞计数(约1×10⁷的细胞),离心(1100rpm×5min)收集细胞;

2、用4℃预冷的PBS重悬,将细胞移至1.5ml EP管中,1×PBS洗一遍;

3、加300ul RIPA/1×10⁷的细胞,裂解细胞,至冰上15-30min;

RIPA+PMSF(1:100)+Cocktail(1:1000)

4、4℃预冷离心:13000rpm ×10-15min;

5、将离心后的上清转移至新的已4℃预冷的1.5ml EP管,冰上备用(总蛋白);

6、用1×PBS洗管底的pellet×2遍;

7、加入Urea-Lysis buffer 10-15ul裂解pellets,vortex 10min;

8、4℃预冷离心:13000rpm ×10min;用BufferA 90ul稀释,此为核基质蛋白。

RIPA(PH 8.0):

150mM NaCL

1% NP-40

0.5% DOC

0.1% SDS

50mM Tris

Urea-Lysis buffer(PH 8.0):

100mM NaH2PO4

10mM Tris-HCL

300mM NaCL

8M urea

Buffer A:

100mM NaH2PO4

10mM Tris-HCL

300mM NaCL

1% Triton X-100

植物组织蛋白质提取方法

1、根据样品重量(1g 样品加入3.5ml 提取液,可根据材料不同适当加入),准

备提取液放在冰上。

2、把样品放在研钵中用液氮研磨,研磨后加入提取液中在冰上静置(3-4 小时)。

3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃

4、提取上清夜,样品制备完成。

蛋白质提取液:300ml

1、1Mtris-HCl(PH8) 45ml

2、甘油(Glycerol)75ml

3、Polyvinylpolypyrrordone 6g

这种方法针对SDS-PAGE,垂直板电泳!

或者用C2HCl3O2—C₃H₆O沉淀法,这种方法针对双向电泳,杂质少,离子浓度小的特点!当然单向电泳也同样适用,只是电泳的条带会减少!

1、在液氮中研磨叶片

2、加入样品体积3 倍的提取液在-20℃的条件下过夜,然后离心(4℃8000rpm

以上1 小时)弃上清。

3、加入等体积的冰浴C₃H₆O(含0.07%的β-巯基乙醇),摇匀后离心(4℃8000rpm

以上1 小时),然后真空干燥沉淀,备用。

4、上样前加入裂解液,室温放置30 分钟,使蛋白充分溶于裂解液中,然后离心

(15℃8000rpm 以上1 小时或更长时间以没有沉淀为标准),可临时保存在4℃

待用。

5、用Brandford 法定量蛋白,然后可分装放入-80℃备用。

药品:

提取液:含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的C₃H₆O

裂解液:2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中(终体积为5ml),

使用前再加入1M 的DTT65ul/ml

组织:肠黏膜为例

应用TRIPURE 提取蛋白质步骤:

含蛋白质上清液中加入C₃H₈O:(1.5ml 每1mlTRIPURE 用量)

倒转混匀,置室温10min

离心:12000 g,10min,4 度,弃上清

加入0.3M 盐酸胍/95%乙醇:(2ml 每1mlTRIPURE 用量)

振荡,置室温20min

离心: 7500g,5 min,4 度,弃上清

重复0.3M 盐酸胍/95%乙醇步2 次

沉淀中加入100%乙醇2ml

充分振荡混匀,置室温20 min

离心: 7500g,5min,4 度,弃上清吹干沉淀

1%SDS 溶解沉淀

离心:10000g,10min,4 度

取上清-20 度保存(或可直接用于WESTERN BLOT)

存在的问题:加入1%SDS 后沉淀不溶解,还是很大的一块,4 度离心后又多了

白色沉定,SDS 结晶?测浓度,含量才1mg/ml 左右。

解决:提蛋白试剂盒,另外组织大小适中,要碎,立即加2X BUFFER,然后煮

5-10 分钟,效果很好的。

细菌蛋白

用甲醇提取的,冻干后用缓冲液溶解的。样品缓冲液是一般的。其中含又2%的

SDS,20mmol 的2-Hydroxy-1-ethanethiol

肿瘤组织

0-4°C 生理盐水冲洗组织表面血迹,以1:9(即100ug 重量加入900ul 体积)

的比例加入蛋白匀浆提取液,0-4 °C 冰水混合物中用1ml 匀浆器制成10%的蛋

白匀浆。匀浆在10000G 离心10-15 分钟,取上清备用。

注:蛋白匀浆提取液(PH7.6):Nacl 50 mM Tris 10mM EDTA 1mM, PMSF 1 mM,

Na3 VO4 .12H2O 0.5 mM NaF 50 mM Benzamidine 1 mM

脑组织

将切取的组织用4℃预冷的0.01mol/l 的PBS 漂洗去血渍,再用滤纸吸干残留的

PBS,将组织称重,将0.1G 组织放入1ml 的玻璃匀浆器,加入800l 裂解液在冰

上充分匀浆,将得到的匀浆液用液氮反复冻融3 次,室温静置30mins,4℃

15000r/min 离心1h,小心避开脂层,吸取上清,分装,-80℃保存。

裂解液配方如下:

尿素7mol/l

CH₄N₂S  2mol/l

CHAPS 4%(m/v)

DTT 65Mmol/L(上样前临加)

IPG Buffer 0.5%(V/V)(上样前临加)

PMSF 2ug/l(m/V)(上样前临加)

DNA 酶1 2ug/l(m/V)(上样前临加)

RNA 酶A 2ug/l(m/V)(上样前临加)

酵母蛋白的提取方法

1 准备SD/-Leu 或是YPD 培养基20ml,酵母过夜培养,30℃,230rpm。

2 测OD600 约1.0。

3 100ml 过夜培养物,1000g,离心,5min,4℃。

4 弃上清,重悬于80ul 抽提buffer:

0.1M Tris-Cl(PH7.5),0.2M NaCl,0.01Mβ-ME,20%甘油,5mM EDTA,1mM

PMSF。(100×):PMSF 0.1742g 溶于10ml C5H12O(主要抑制丝氨酸蛋白激酶),

RT 保存。

5 转移上清到一预冷的玻璃管中,再加入玻璃珠33ul(425-600um)。冰上操作,

涡流10min,但不包括样品的预冷时间。

6 回收玻璃珠,并尽可能取上清到另一预冷的玻璃管中。

7 40ul 的抽提buffer,同上涡流。

8 离心后分离上清(回收玻璃珠)。

9 液氮快速冷冻,-70℃储存。