蛋白免疫印迹 (western blot, 即 WB), 想必做蛋白相关实验的小伙伴们都很熟悉, 这里就不过多赘述了, 但是做起实验并没那么容易。每当我们准备好样本, 满怀希望自己可以做出这样的实验结果时:

结果却只能得到这样

还有这样, 目的条带傻傻分不清

 

甚至是这样的

面对这些残忍的现实时, 我们该怎么抉择? 重复一次? 换个蛋白? 换个抗体? 显然这些方案都不是更佳的方案。

为了避免出现以上问题, 现在就给大家梳理一下 western blot 中常见问题以及对应的解决方案。

1、条带形状不好看怎么回事?

可能的原因有:

◐ 凝胶的不均匀或聚合不好, 应对策略---灌胶前将溶液充分混匀。

◐ 样本盐浓度较高, 应对策略---样本进行除盐或者将样本盐浓度调成一致。

◐ 缓冲液多次使用, 导致成分发生变化, 应对策略---重新配制。

◐ 凝胶下部有气泡, 应对策略---电泳前先赶走气泡。

◐ 电泳时温度过高, 应对策略---降低电流或电压。

2、没有条带是怎么回事?

可能的原因有:

◐ 二抗的 HRP 活性太强, 将底物消耗光, 应对策略---降低二抗的浓度。

◐ ECL 底物中 H2O2 不稳定, 失活, 应对策略---更换 ECL。

◐ ECL 底物没有覆盖到相应的位置, 应对策略---重新洗膜之后再次曝光。

◐ 一抗使用不当或者二抗失效, 应对策略---在有效期内使用抗体, 并对应来源。

3、背景高咋回事呢?

可能原因有:

◐ 洗膜不充分, 应对策略---建议增加洗液体积和洗涤次数。

◐ 封闭不彻底, 应对策略---提高封闭液的浓度, 孵育时间, 保证封闭液完全浸没转印膜。

◐ 封闭物使用不当, 比如检测生物素标记的蛋白时不可以用脱脂奶粉, 应对策略---针对不同的蛋白使用不同的封闭物。

◐ 抗体非特异性结合, 应对策略---可以降低抗体的浓度或者减少孵育的时间。